Молекулярные методы исследований приобретают все большую популярность в прикладных областях биологических наук. Несмотря на сложность и дороговизну данных методов исследований, ряд областей аграрного профиля, такие как селекция, микробиология, вирусология, эпизоотология, ветеринарно-санитарная экспертиза, клиническая диагностика и др., уже не могут обходиться без молекулярного подтверждения своих разработок и технологий.
Сегодня можно выделить несколько направлений в разработке аграрных ДНК-технологий:
- Разработка молекулярных методов контроля качества сельскохозяйственного сырья и продуктов питания.
- Тотальное генотипирование организмов, создание генетических паспортов ородгенет таксономических групп.
- Выявление генетических заболеваний на ранних стадиях развития.
- Диагностика инфекционных заболеваний сельскохозяйственных животных и проведение эпизоотологического мониторинга.
- Исследование генома сельскохозяйственных животных на наличие продуктивных качеств для решения селекционных задач.
Некоторые из этих направлений не только достаточно разработаны, но и внедрены в практику аграрных технологий, другие — находятся на стадии научной разработки и апробации.
ПЦР-технология на настоящий момент, широко используемый метод, позволяющий в течение суток проанализировать исследуемую ДНК.
Однажды, во время воскресной поездки в живописные горы Калифорнии, Кэрри Мюллису пришла неожиданная мысль, как продолжить накопление фрагментов ДНК путем многократного повторения реакции, включающей цикличные изменения режимов денатурации и синтеза ДНК. Так, в 1983 году была предложена схема амплификации (умножения) неограниченного количества копий ДНК, за которую автор, спустя 10 лет был удостоен Нобелевской премии. Последовательность реакции оказалась настолько простой и неожиданной, что научная общественность не сразу смогла осознать её значимость. Метод полимеразной цепной реакции (ПЦР) обеспечивает многократное увеличение в условиях in vitro фрагментов ДНК, превышающих исходное в 108 раз. Таким образом, в течение нескольких часов можно увеличить и получить практически в любых количествах искомую последовательность ДНК, которая изначально могла быть представлена одной молекулой. Сущность ПЦР составляет многократный циклический процесс, включающий полимеразную реакцию и денатурацию вновь синтезированной двунитевой ДНК, что приводит к значительному увеличению количества исходного материала. Успеху и интенсивному применению ПЦР-метода способствовало открытие термостабильной полимеразы, выделенной из бактерий, живущих в термальных источниках (Thermus aquaticus). В отличие от фрагмента Клёнова ДНК-полимеразы 1 Е. coli, использовавшегося ранее, Тад-полимераза сохраняет свою активность после денатурации ДНК, поэтому нет необходимости замены фермента после каждого цикла, как в случае с фрагментом Клёнова. Следующее достоинство — температурный режим детерминируемой реакции, что значительно повышает специфичность, количественный выход и необходимую длину синтезированных копий интересующих нас последовательностей.
Одной из основных составляющих реакции амплификации являются т. н. «праймеры», искусственно синтезированные короткие фрагменты ДНК (олигонуклеатиды), которые состоят из 20-30 оснований. Эти фрагменты комплементарны специальным участкам на исследуемой ДНК, так называемым сайтам, к которым во время процедуры «отжига» и «прилипают» праймеры. Отбор праймеров является основным фактором, определяющим конечную специфичность реакции, поэтому необходимо знание нуклеотидной последовательности генома не только конкретного организма, но и близких ему по происхождению [1]. Поскольку проведение реакции связано с высокими температурами и их резкими изменениями, поэтому используется оригинальный фермент Тад-полимераза, впервые выделенный ещё в СССР из микроорганизмов (Thermus aquaticus), живущих в горячих источниках и обладающих высокой термостабильностью, сохраняющих ферментативную активность в процессе жесткого температурного режима от 30°С до 95°С. Суть метода ПЦР заключается в синтезе исследуемой ДНК при помощи праймеров и Тад-полимеразы, в увеличении количества её фрагментов, с целью дальнейшей детекции. Проведение ПЦР-анализа происходит циклами. Каждый цикл состоит из трёх стадий, которые происходят при различных температурах [2]:
1) «денатурация» — две нити ДНК расплетаются;
2) «отжиг» — синтезированные праймеры (олигонуклеотиды) длиной 20-30 нуклеотидов за счёт комплементарности связываются с нужным участком;
3) синтез (удлинение) новой цепи ДНК происходит при участии Тад-полимеразы и свободных нуклеотидов за каждым праймером в направлении 5'-3'. Таким образом, получаются две новые двуцепочечные молекулы ДНК. Третья стадия останавливается при повышении температуры и денатурации новосинтезированных молекул ДНК. В смеси накапливаются короткие синтезированные фрагменты ДНК — ампликоны.
В первом цикле праймеры «отжигаются» с исходной матричной ДНК, а затем (в последующих циклах) с вновь синтезированными молекулами ДНК по мере их накопления в растворе. В последнем случае синтез ДНК заканчивается не при изменении температурного режима, а по достижении ДНК-полимеразной границы амплифицированного участка, что и определяет, в конечном счете, размер вновь синтезированного участка ДНК с точностью до одного нуклеотида.
Полимеразная цепная реакция проводится в программируемом термостате — термоциклере (амплификаторе), в котором автоматически изменяется температурный режим. Такой прибор позволяет задавать нужное количество циклов и выбирать оптимальные временные и температурные режимы для каждого цикла. Один цикл может продолжаться более 5 минут и за весь период происходит до 50 циклов, вследствие чего количество копий ДНК увеличивается экспоненциально, приблизительно по формуле 2n, где n — число прошедших циклов амплификации. Следующим этапом ПЦР является её детекция или выявление амплифицированной ДНК. Полученную смесь разделяют в электрическом поле в полиакриламидном или агарозном геле с помощью электрофореза. Такой метод позволяет выявить ДНК не только качественно, но и количественно. Аналитическая чувствительность метода или минимальное количество ДНК в 1 миллилитре раствора образца колеблется в пределах 500-1000 копий ДНК, а при использовании коммерческих наборов повышается разрешающая способность метода до 2-4 копий. Единственным недостатком ПЦР-метода является контаминация компонентов реакции, наличие чужеродной ДНК в растворе, что может привести к появлению ложноположительных результатов при диагностике ДНК. Предупредительными мерами по предотвращению контаминации служит чёткое разделение лаборатории территориально на зоны в зависимости от задачи исследований и тщательный отбор материала.
Простота реализации ПЦР-метода и последующего анализа продуктов ПЦР в лабораторных условиях в немалой степени определило масштабное использование этого метода в научно-исследовательской практике. Среди различных молекулярных методов, направленных на изучение генетических структур, метод ПЦР занял самые передовые позиции, так как существенно ускорил проведение генетического анализа организмов разных уровней эволюции — от простейших до человека — путём сравнения нуклеотидных последовательностей ДНК.
В диагностическом плане ПЦР потеснила молекулярную гибридизацию, широко применяющуюся в молекулярно-генетических исследованиях. За прошедшие 10 лет ПЦ-реакция нашла применение практически во всех областях современной биологии, да же такое масштабное явление, как изучение эволюции современных и исчезнувших организмов стало подвластно исследователю. ДНК любого индивидуума является результатом его эволюционной истории, которую можно рассматривать как процесс, обеспечивающий, с одной стороны, совершенствование вида, а с другой стороны, увеличение разнообразия видов организмов. И в этом направлении ПЦР как метод исследования, способствующий определению нуклеотидных последовательностей в геноме, может решать задачи не только по выяснению законов развития в микро- , но и в макромире, поскольку генетическая информация, закодированная в нуклеотидной последовательности ДНК структурных генов, в конечном счёте реализуется в виде последовательности аминокислот в белках. Оценка степени изменчивости и частоты вариантных форм белка в популяции методом ПЦР позволяет провести выборку гомологичных генов среди разных особей. Ранее подобную процедуру осуществляли при помощи гель-электрофореза, позволившего установить свыше 700 аминокислотных последовательностей различных белков. Чтобы представить грандиозность и трудоёмкость этой работы, следует знать, что определение точной аминокислотной последовательности даже одного белка требует для своего решения нескольких месяцев, а то и лет кропотливой работы.
Возможности ПЦ-реакции активно расширяются и уже разработаны методики, основанные на принципе молекулярной амплификации:
- ПЦР с геноспецифическими праймерами. В первом варианте ПЦР-анализ можно называть классическим, когда применяют два разных праймера, специфичных к известной нуклеотидной последовательности, для выявления гена, для увеличения количества исследуемого фрагмента, для последующего анализа.
- ПЦР с неспецифическими (произвольными) праймерами. Этот модифицированный метод ПЦР с использованием коротких фрагментов ДНК генетически не специфичных исследуемой ДНК, называется RAPD-PCR (randomamplifiedpolimorphicDNA) [З]. Суть метода состоит в том, что в роли праймера используется произвольный олигонуклеотид, способный гибридизироваться с исследуемой ДНК и амплифицировать её. В настоящее время RAPD-технология широко используется в изучении генома (конструирование генетических карт, анализ генетической структуры популяций, генотипирование, маркирование признаков).
- Полиморфизм длин амплифицированных фрагментов.
Сочетание двух актуальных молекулярно-генетических методов исследований дало начало новому методу — полиморфизму длин амплифицированных фрагментов AFLP (amplified sequence polymorphism) [3]. Этот метод обладает важным преимуществом: для его использования не требуется знать ни первичной последовательности ДНК, ни нуклеотидной последовательности праймеров. Метод включает в себя: рестрикцию — на этом этапе геномная ДНК расщепляется ферментами рестрикции, включение олигонуклеотидного праймера с ДНК-рестриктами. Образование ДНК-ДНК участка на концах рестриктных фрагментов является универсальной мишенью для амплификации, которая идёт по всем рестриктным фрагментам. Таким образом, варьируя нуклеотидной последовательностью праймеров и применяя различные рестриктазы, можно добиться амплификации лишь нескольких фрагментов, которые могу быть использованы как фингерпринт («отпечаток пальцев»).
Метод AFLP применяется для исследований полиморфизма ДНК, который может быть использован как при картировании генома, так и при получении геномного отпечатка конкретного индивидуума.
- ПЦР-ПДРФ. Актуальным методом изучения полиморфизма ДНК стал метод ПЦР-ПДРФ, который, в отличие от метода AFLPs, сначала амплифицирует исследуемую ДНК, а потом её подвергает действию различных рестриктаз. Данный метод широко применяется при геномной «дактилоскопии» организмов, при анализе точковых мутаций, приводящих к различным наследственным порокам, а также напрямую или косвенно связанных с хозяйственно-полезными признаками [4].
В нашей статье приведены лишь некоторые модификации метода ПЦР, далее остановимся на конкретном применении ПЦР при молекулярно-генетических исследованиях сельскохозяйственных животных.
Использование методов ДНК-технологий для диагностики заболеваний животных.
Особенности ведения современного сельского хозяйства в мировом масштабе приводят к появлению ряда новых проблем. Широкий обмен генетическим материалом между разными странами сопровождается распространением различных инфекционных заболеваний (например, губчатая энцефалопатия у крупного рогатого скота), а также заболеваний, вызываемых редкими мутациями, возникающими у выдающихся представителей коммерческих пород. В отдельных случаях наблюдается очень высокая скорость распространения таких мутаций. Огромный экономический ущерб в результате их распространения приводит к необходимости строгого генетического контроля импортируемого генетического материала.
Основными молекулярными методами диагностики возбудителей инфекционных заболеваний является применение ДНК-зондов и полимеразная цепная реакция. Использование данных методов при выявлении возбудителей инфекционных болезней очень тесно связано с их типированием, выявлением полиморфизма генов, установлением генома патогенных штаммов, возможности клонирования генов и создания генно-инженерных вакцин.
В диагностике инфекционных возбудителей животных выделяют две области применения ПЦР:
- Выявление ДНК возбудителя;
- Типирование штаммов микроорганизмов (фингерпринт).
В последние годы большое внимание уделяется разработке ПЦР-тест-систем (диагностикумов), относящихся к области инфекционных заболеваний.
Простота, высокая чувствительность, хорошая воспроизводимость быстро превратили этот метод в один из наиболее перспективных диагностических методов.
Преимуществами применения метода ПЦР в диагностике инфекционных болезней являются следующие:
1. Прямое определение наличия возбудителей инфекционных болезней. Многие традиционные методы диагностики выявляют белковые маркёры, являющиеся продуктами жизнедеятельности инфекционных агентов, что даёт лишь опосредованное свидетельство наличия инфекции. ПЦР даёт выявление специфической ДНК и прямо указывает на присутствие возбудителя инфекции.
2. Высокая чувствительность. ПЦР-методы дают возможность обнаруживать патогенные бактерии и вирусы даже в тех случаях, когда другими методами (иммунологическими, бактериологическими и др.) их выявление невозможно. Чувствительность амплифицированных тест-систем составляет около 10 клеток в пробе, достигая максимально возможных значений — 1 клетка в пробе, в то время как чувствительность иммунологических и микробиологических тестов колеблется в пределах до миллиона клеток.
3. Высокая специфичность. Абсолютная специфичность метода обусловлена тем, что в исследуемом материале выявляется уникальный, характерный только для данного вида возбудителя, фрагмент ДНК.
4. Быстрота получения продукта. За счёт автоматизации процесс амплификации занимает всего 2-3 часа, а с учётом времени, затрачиваемого на обработку проб и регистрацию результатов, определение возбудителя обычно осуществляется в течение одного рабочего дня.
5. Работа с любым биологическим материалом. Метод ПЦР позволяет проводить определение возбудителя непосредственно в материале, полученном от больного животного (кровь, сыворотка, мазки, смывы, соскобы, слюна, мокрота, желудочный сок, биопсийный материал). Для определения не требуется культивирование возбудителя.
6. Возможность количественного учёта реакции. Метод позволяет осуществлять как качественное, так и количественное определение возбудителя. Изменение динамики числа копий возбудителя в пробе даёт возможность контролировать виремию или бактериемию в процессе лечения и однозначно решать вопрос об эффективности терапии.
7. Безопасность работы с исследуемым материалом, так как он может быть дезинфицирован химической и термической обработкой в момент его забора, что исключает инфицированность специалистов в процессе проведения ПЦР.
8. Одномоментность выявления различных возбудителей в одной пробе.
9. Простота исполнения за счёт полной автоматизации.
Разработка методик ПЦР и проведение испытания приборов и оборудования — это один из этапов большой работы по внедрению ПЦР-методов в практику диагностических лабораторий. В связи с возрастающим интересом к практической ПЦР-диагностике, внедрение методов ПЦР в систему государственной ветеринарной службы — дело сегодняшнего дня. Необходимо отметить, что перспективными направлениями ПЦР являются определение антибиотикорезистентности клинических штаммов возбудителей, возможность количественного учёта результатов для контроля динамики инфекционного процесса, правильного выбора тактики лечения и оценки эффективности применяемых лекарственных средств.
К настоящему времени ветеринарными специалистами уже разработаны тест-системы для диагностики методом ПЦР таких заболеваний как туберкулёз, сибирская язва, лейкоз, чума крупного рогатого скота, бешенство, ящур, бруцеллез, кампилобактериоз, листериоз, хламидиоз животных; классическая чума свиней, респираторно-репродуктивный синдром свиней, парвовирусная инфекция свиней, энцефаломиокардит свиней; сальмонеллез, стафилококкоз, микоплазмоз. болезнь Марека, реовирусная инфекция, болезнь Гамборо, инфекционный бронхит птиц, Ньюкаслская болезнь; чума мясоедных, вирусный энтерит норок, вирусный гепатит утят.
Список литературы:
1. Анализ генома. Методы. Москва. «Мир», 1990.
2. В. И. Глазко, Е. В. Шульга, Т. Н. Дымань, Г. В. Глазко. «ДНК-технологии и биоинформатика в решении проблем биотехнологий млекопитающих». БелаяЦерковь-2001.
3. Zabeau M., Vos P. Selective restriction fragment amplificanion: a general method for DNA fingerprinting // European Patent Application 924026297( Publication number:053458 At).
4. Сулимова Г. Е. Полиморфизм длин рестрикционных фрагментов ДНК у сельскохозяйственных видов: методы изучения и перспективы тестирования // Успехи современной генетики-1993. Вып. 18, с. 18-24.
5. Дубинина И. П. Использование метода ПЦР в клинико-диагностических лабораториях. //Лаборатория-1996, №4. -с. 4-6.
6. Пономарёв А. Б. Совершенствование лабораторно-диагностической работы в России.// Ветеринария-1998,
№-3. -с. 3-5.
