Главная / Каталог ветеринарных препаратов / Диагностикумы / ТЕСТ-СИСТЕМА ДЛЯ ОБНАРУЖЕНИЯ ВИРУСА ТРАНСМИССИВНОГО ГАСТРОЭНТЕРИТА (ТГС) И ДИФФЕРЕНЦИАЦИИ ЕГО ОТ РЕСПИРАТОРНОГО КОРОНАВИРУСА СВИНЕЙ (РКВС) МЕТОДОМ ПОЛИМЕРАЗНОЙ ЦЕПНОЙ РЕАКЦИИ (ПЦР)
ТЕСТ-СИСТЕМА ДЛЯ ОБНАРУЖЕНИЯ ВИРУСА ТРАНСМИССИВНОГО ГАСТРОЭНТЕРИТА (ТГС) И ДИФФЕРЕНЦИАЦИИ ЕГО ОТ РЕСПИРАТОРНОГО КОРОНАВИРУСА СВИНЕЙ (РКВС) МЕТОДОМ ПОЛИМЕРАЗНОЙ ЦЕПНОЙ РЕАКЦИИ (ПЦР)
Внимание! Этот справочник доступен на CD. Подробная информация обо всех препаратах, удобный поиск, автоматическое обновление каталога. Подробнее »»
Алфавитный указатель | Препараты по производителям | Препараты по заболеваниям | Поиск
- Название
- ТЕСТ-СИСТЕМА ДЛЯ ОБНАРУЖЕНИЯ ВИРУСА ТРАНСМИССИВНОГО ГАСТРОЭНТЕРИТА (ТГС) И ДИФФЕРЕНЦИАЦИИ ЕГО ОТ РЕСПИРАТОРНОГО КОРОНАВИРУСА СВИНЕЙ (РКВС) МЕТОДОМ ПОЛИМЕРАЗНОЙ ЦЕПНОЙ РЕАКЦИИ (ПЦР)
- Состав и форма выпуска
- Состоит из следующих наборов:
Набор для выявления РНК вируса ТГС и РКВС методом ПЦР (состоит из 8 компонентов):№ Название набора и количество анализов 1 Набор для выявления РНК вируса ТГС и РКВС методом ПЦР (50 анализов) 2 Набор для выделения РНК (50 образцов) 3 Набор для проведения электрофореза (5 гелей по 10 образцов)
При точном соблюдении наставления по применению анализ занимает от 8 до 16 часов (в зависимости от условий выделения). Флаконы и пробирки упаковывают в полиэтиленовые пакеты с наименованием тест-системы и каждого набора.Наименование Количество Упаковка Термостабильная ДНК-полимераза 25 мкл 1 пробирка Мезофильная ревертаза 7 мкл 1 пробирка Инактивированная культура вируса ТГС (положительный контроль) 200 мл 1 пробирка Праймеры ПЦР-1 с нуклеозидтрифатами (dNTPs 2,5 mM каждого): 225 мкл 1 пробирка Праймеры ПЦР-2 с нуклеозидтрифатами (dNTPs 2,5 mM каждого): 225 мкл 1 пробирка Реакционный буфер для ОТ-ПЦР 1600 мкл 1 пробирка Деионизованная вода (отрицательный контроль) 1,5 мл 1 флакон Вазелиновое масло 4 мл 1 флакон Набор для выделения РНК (состоит из 5 компонентов): Наименование Количество Упаковка Раствор № 1 55 мл 1 флакон Раствор № 2 10 мл 1 флакон Раствор № 3 10 мл 1 флакон Сорбент 2 мл 1 пробирка Набор для проведения электрофореза (состоит из 4 компонентов на 5 гелей по 10 образцов): Наименование Количество Упаковка Агароза 5 г 1 флакон 50-кратный TAE буфер для электрофореза 20 мл 1 флакон Раствор бромистого этидия (10 мг/мл) 150 мкл 1 пробирка Буфер для нанесения образца 300 мкл 1 пробирка - Фармакологические свойства
- Обнаружение РНК вируса трансмиссивного гастроэнтерита (ТГС) и дифференциация ее от РНК респираторного коронавируса свиней (РКВС) проводится с использованием полимеразной цепной реакции (ПЦР). Перед проведением ПЦР необходимо провести реакцию обратной транскрипции (РНК преобразуется в ДНК). В основе метода ПЦР лежит многократное цикличное повторение трех процессов: денатурации ДНК; гибридизации (<отжига>) исследуемой ДНК со специфическими олигонуклеотидными зондами (праймерами); синтеза комплементарных цепей ДНК с помощью термостабильной ДНК-полимеразы. В результате проведения N циклов амплификации концентрация синтезированного фрагмента в исследуемой пробе увеличивается в 2 раза (например, в миллион раз после 20 циклов), что позволяет учитывать результаты анализа с помощью электрофореза ДНК в агарозном геле. РКВС является делеционным мутантом вируса ТГС. Тест-система устроена таким образом, что после проведения <гнездовой> ПЦР на матрице вируса ТГС образуется фрагмент размером 874 п. н., тогда как на матрице РКВС образуются короткие фрагменты размером 192 — 253 п. н. (в зависимости от штамма). Места посадки праймеров являются консервативными для вирусов ТГС и РКВС, следовательно, условия амплификации также будут одинаковые. С помощью размеров ПЦР-фрагмента происходит дифференцирование двух вирусов.
- Показания
- Для обнаружения вируса ТГС и дифференцирования его от РКВС. С помощью данной тест-системы вирус ТГС может быть обнаружен в инфицированных культурах клеток и патматериале от больных животных (кровь, сперма, фекалии, образцы кишечника, кусочки органов от павших или вынужденно убитых животных).
- Дозы и способ применения
- Выделение РНК из исследуемого биологического материала проводят с помощью Набора для выделения РНК. Подготовка исследуемых образцов — СПЕРМА: 200 мкл сперма переносят в полипропиленовую пробирку на 1,5 мл и используют для анализа. КРОВЬ: Допускается однократное замораживание проб до исследования при температуре минус 8 C — минус 20 C. 200 мкл крови переносят в полипропиленовую пробирку на 1,5 мл и используют для анализа. ТКАНИ: Ткани гомогенизируют в физиологическом растворе или в растворе для выделения № 1. 200 мкл гомогената переносят в полипропиленовую пробирку на 1,5 мл и используют для анализа. ФЕКАЛИИ: суспендируют в фосфатном буфере, затем центрифугируют при 9000 g в течение 10 минут при 4 C. Для выделения РНК используют 200 мкл супернатанта. Выделение РНК для анализа: Образцы исследуемого биологического материала (в объеме до 200 мкл) помещают в полипропиленовые пробирки объемом 1,5 мл и добавляют 1,1 мл раствор № 1. Инкубируют 10 минут при температуре (20 + 2 C), периодически перемешивая. Пробы центрифугируют в настольной центрифуге типа <Эппендорф> 1 минуту при 13000 об/мин. После центрифугирования надосадочную жидкость переносят в чистые пробирки, а осадок отбрасывают. К полученной суспензии добавляют 40 мкл сорбента и инкубируют при температуре (20 + 2 C) в течение 10 минут, 1 — 2 раза перемешивая на смесителе типа
. Затем центрифугируют 15 секунд на микроцентрифуге при 13000 об/мин, надосадочную жидкость отбрасывают. К осадку добавляют 0,1 мл раствора № 2, перемешивают на смесителе типа и осаждают сорбент центрифугированием в течение 15 секунд, надосадочную жидкость отбрасывают. Процедуру повторяют 2 раза. К осадку добавляют 0,1 мл раствора № 3, перемешивают на смесителе типа и осаждают сорбент центрифугированием в течение 15 секунд, надосадочную жидкость отбрасывают. Процедуру повторяют 2 раза. Осадок подсушивают в течение 10 — 15 минут при 56 C с открытой крышкой. К осадку добавляют 30 мкл деионизованной воды, перемешивают и инкубируют 10 — 15 минут при 56 C в закрытых пробирках. Центрифугируют в течение 1 минуты при 13000 об/мин. Отобранную надосадочную жидкость используют для проведения ПЦР. На всех стадиях обработки биоматериала удаление супернатанта производить одноразовыми пластиковыми наконечниками при помощи водоструйного насоса в колбу-ловушку, содержащую дезинфицирующий раствор (3 % хлорамин или 5 % перекись водорода и т. п.) Все манипуляции, связанные с использованием тест-системы ПЦР, проводятся пипеточными дозаторами типа <Ленпипет> следующих объемов: 0 — 20 мкл, 20 — 200 мкл, 0 — 1000 мкл с использованием полипропиленовых пробирок на 1,5 мл (ПО <Ленполимер>) и 0,5 мкл и наконечников к пипеточным дозаторам одноразового использования. Проведение реакции амплификации: Реакцию амплификации проводят, используя Набор для выявления РНК вируса ТГС и РКВС методом ПЦР. Для выявления РНК вируса ТГС и дифференциации его от РКВС был разработан метод ОТ-ПЦР <в одной пробирке>. При данной постановке реакции стадия обратной транскрипции и стадия амплификации проходят в одной пробирке, последовательно. При этом преимуществом является то, что данная постановка реакции уменьшает вероятность получения ложноположительных результатов, т. к. не требуется дополнительного открывания пробирок. Пробирки для ОТ-ПЦР подготавливают, пронумеровав их и поставив их в штатив по порядку. Вместе с пробирками для исследуемых проб подготавливают пробирки для K+ (РНК, выделенная из 20 мкл контрольной культуры, прилагающейся к набору и K- (деионизованная вода). Подготавливают смесь для ОТ-ПЦР по следующей схеме: (в число пробирок N входят и контроли)
Мезофильная ревертаза и термостабильная ДНК-полимераза добавляется в последнюю очередь. После добавления всех компонентов смесь перемешивают пипетированием и разливают по пробиркам по 20 мкл. Затем в каждую пробирку добавляют по 5 мкл выделенной РНК. В пробирку с K+ добавляют 5 мкл РНК, выделенной из 20 мкл контрольной культуры, а в пробирку с K- добавляют 5 мкл деионизованной воды и перемешивают пипетированием. Если образовались капли на стенках пробирки, то их осаждают центрифугированием (1300 об/мин 5 — 10 секунд). На поверхность водной фазы осторожно наносят 40 мкл (2 — 3 капли) вазелинового масла. Пробы амплифицируют на амплификаторе. Температурный режим: 50 °C — 60 минут 95 °C — 5 минут 1 цикл 95 °C — 30 секунд 55 °C — 30 секунд 5 циклов 72 °C — 50 секунд 95 °C — 30 секунд 60 °C — 30 секунд 25 циклов 72 °C — 50 секунд 72 °C — 5 минут 1 цикл После проведения амплификации проводят реакцию реамплификации. Реакцию реамплификации проводят согласно выше изложенному, но вместо 5 мкл РНК добавляют 5 мкл продукта ПЦР-1 и вместо праймеров ПЦР-1 добавляют праймеры ПЦР-2 (p-p № 5). Матрицу вносят в последнюю очередь. Смесь для ПЦР-2:Реактив на 1 пробу (мкл) на проб Реакционный буфер для ОТ-ПЦР (p-p № 6) 15,12 15,12 х (N+1) Праймеры ПЦР-1 (p-p № 4) 4,5 15,12 х (N+1) Термостабильная ДНК-полимераза (p-p № 1) 0,25 0,25 х (N+1) Мезофильная ревертаза (p-p № 2) 0,13 0,13 х (N+1)
Температурный режим циклов ПЦР: 95 °C — 30 секунд 55 °C — 30 секунд 5 циклов 72 °C — 50 секунд 95 °C — 30 секунд 60 °C — 30 секунд 25 циклов 72 °C — 50 секунд 72 °C — 5 минут 1 циклРеактив на 1 пробу (мкл) на проб Реакционный буфер для ОТ-ПЦР (p-p № 6) 15,25 15,25 х (N+1) Праймеры ПЦР-2 (p-p № 4) 4,5 4,5 х (N+1) Термостабильная ДНК-полимераза (p-p № 1) 0,25 0,25 х (N+1)
Соотношение циклов амплификации и реамплификации 30 : 30. Учет результатов амплификации. Результаты исследования учитываются путем анализа продуктов амплификации исследуемых образцов методом электрофореза в агарозном геле (Набор для проведения электрофореза). Приготовление буфера для электрофореза. Для приготовления 1 л однократного буфера для электрофореза к 20 мл 10 х TAE буфера добавить 980 мл дистиллированной воды и 25 мкл раствора бромистого этидия (p-p № 16). Буфер можно приготовить самостоятельно по следующей прописи: навеску 4,04 г триса растворяют в 200 мл дистиллированной воды, добавляют 1,14 мл ледяной уксусной кислоты и 2 мл 0,5 М раствора ЭДТА pH 8 и доводят объем буфера до 1000 мл дистиллированной водой. После растворения компонентов буфера добавляют 25 мкл раствора бромистого этидия (p-p № 16). Приготовление агарозного геля. К 100 мл однократного буфера для электрофореза добавляют 2 г агарозы, доводят до кипения и охлаждают до 45 °C . Заливают в специальную форму с гребенкой и дают затвердеть. Гребенку осторожно вынимают и форму с агарозой переносят в аппарат для горизонтального электрофореза (ПГ-9 <Диа — М>) и погружают в буфер. Электрофорез продуктов амплификации. К 7 мкл полученной амплификационной смеси (водной фазы) добавляют 1,5 мкл буфера для внесения образца (раствор № 7), перемешивают пипетированием и полученный образец вносят в лунки агарозного геля, образовавшиеся от зубцов гребенки. Электрофорез проводят при напряжении 8 вольт/см длины геля, в течение 60 минут. За это время краситель успевает пройти не менее половины геля. Направление движения образцов в геле от <минуса> к <плюсу>. Учет результатов электрофореза. Результаты электрофореза просматривают в ультрафиолетовом свете с длинной волны 254 нм на приборе <Трансиллюминатор>. После окрашивания результаты реакции выявляются в виде светящихся красноватых полос. Положительными (т. е. содержащими вирус ТГС) считаются пробы, в которых полосы в геле располагаются на таком же расстоянии от страта, что и полоса положительного контроля. Если в пробе содержится вирус РКВС, размер амплификационного фрагмента будет 192 — 253 п. н. (в зависимости от штамма). Исследуемые пробы считаются отрицательными, если в них не выявлено никаких полос или они не соответствуют по размеру фрагменту в положительном контроле (располагаются на другом расстоянии от страта). В отрицательном контроле не должно выявляться никаких полос. Размер фрагментов после проведения ПЦР на матрице РНК вируса ТГС и РКВС.Реакция Матрица Праймеры Амплификация кДНК смесь праймеров № 1 Реамплификация 1-я амплификация смесь праймеров № 2
Полученные результаты можно документировать на фотопленке <Микрат — 300> аппаратом типа <Зенит> с оранжевым светофильтром.Матрица Размер фрагментов ПЦР-1 ПЦР-2 Вирус ТГС 1006 п. н. 874 п. н. РКВС 325 -385 п. н. 192 — 253 п. н. - Особые указания
- Строгое соблюдение условий хранения компонентов. Разовое (однократное) использование наконечников и пробирок. Ранее использованные и мытые наконечники и пробирки использовать нельзя. При составлении смеси для амплификации вначале готовить отрицательный контроль, а последним — положительный контроль. Посуда для отбора образцов биоматериала должна быть одноразовой или тщательно обработана хромпиком и отмыта. Пробирки с вирусным материалом должны быть всегда закрытыми. При отборе вируссодержащих суспензий работать наконечниками с фильтром. Перед открыванием пробирок капли жидкости на крышке удалять центрифугированием. При открывании и закрывании пробирок избегать случайного касания руками или инструментами внутренней поверхности крышек.
- Условия хранения
- Набор 1 — при температуре минус 20 °C, набор 2 и 3 — при температуре от 2 до 6 °C. Транспортирование производят в теплоизолирующей упаковке (термос, пенопластовая коробка) при температуре от минус 10 до минус 20 C). Срок годности — 6 месяцев.
- Производитель
- НАРВАК НПО ЗАО, Россия
Адрес: 123098, г. Москва, ул. Гамалеи, д. 16.
Тел./факс: (495) 916-10-67, 916-17-05, 916-11-59,
190-75-61, 190-28-72, 190-30-54, 787-69-32, 787-69-33
Все препараты производства НАРВАК НПО ЗАО, Россия - Продавец
- Место Вашей рекламы
По вопросам размещения информации
о ветеринарных препаратах и кормовых добавках
в Электронном справочнике "Ветеринарные препараты в России"
и заключения договоров на публикацию
обращайтесь в ООО "Ветторг" по электронной почте: vettorg@mail.ru
2006–2024 ООО «ВЕТТОРГ». Все права защищены. Свидетельство о регистрации средства массовой информации ПИ 77-5870 от 30.11.2000 г.
Использование информации в любых целях без разрешения ООО «Ветторг» запрещено.